專題蛋白質技術的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗

[原理]
蛋白質在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質比例的SDS-蛋白質多肽復合物，該復合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質的分子量大小有關，因此可以濃縮和分離蛋白質多肽。

聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質多數采用一種不連續的緩沖系統，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強度也相應不同，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復合物沿移動的界面移動，在分離膠表面形成了一個極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應。

[試劑]
1、30%凝膠貯備液：稱取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis），加蒸餾水至100ml，濾紙過濾貯存。
2、10% SDS：稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。
3、10%過硫酸胺（AP）
4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）
5、5×電泳緩沖液：于900ml蒸餾水中分別加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混勻后加蒸餾水至1 000ml。
6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)
7、電泳加樣緩沖液
10mmol/LpH6.8 Tris
200mmol/LDTT
4%SDS
0.2% 溴酚蘭
20% 甘油
8.正丁醇

[器材]
1、移液器
2、移液管
3、燒杯
4、垂直電泳槽
5、電泳儀

[操作步驟]
1.配制分離膠濃度8%、體積15ml
H2O 6.9ml
30%凝膠貯備液 4.0ml
1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml
10%SDS 0.15ml
10%過硫酸胺 0.15ml
TEMED 0.01ml
2.一旦加入TEMED，混勻后立即小心地將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，為成層膠留有足夠空間。用毛細管輕輕在其頂層加入幾毫升正丁醇，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
3.聚合完成之后，倒掉覆蓋液體，用去離子水洗凝膠上部數次，盡可能用吸水紙吸干頂端的殘存液體。
4.配制5%成層膠5ml，插入梳子，小心避免混入氣泡，垂直放置室溫下。

H2O 3.4ml
30%凝膠貯備液 0.83ml
1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml
10%SDS 0.05ml
10%過硫酸胺 0.05ml
TEMED 0.01ml
5.在成層膠聚合時，將樣品與加樣緩沖液混勻，100℃加熱3min。
6.成層膠聚合完成后，用去離子水沖洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，將凝膠放入電泳槽上。
7.加樣
8.電泳：開始時電壓為8V/cm凝膠，染料進入分離膠后，將電壓增加到15V/cm凝膠，繼續電泳直到染料抵達分離膠底部，斷開電源。
9.取下凝膠，固定、染色或進行Western blot分析。